Neste processo, o DNA é submetido a algum processo físico (exposição à ondas ultrassônicas, centrifugação). Isto gera uma fragmentação que atende melhor aos requisitos do processo de montagem (Figura 3). Os fragmentos resultantes são selecionados por tamanho, replicados e seqüenciados.
O maior problema do shotgun é que ele gera fragmentos potencialmente únicos. Uma vez que o processo de seqüenciamento necessita de várias cópias da mesma molécula, são realizadas clonagens dos fragmentos. Isto é feito inserindo o fragmento de DNA em um microorganismo vetor (vírus ou bactérias). Durante a sua reprodução, o vetor cria novas cópias da seqüência, constituindo um método eficiente de ampliação. Porém, mutações e contaminações pelo DNA hospedeiro podem gerar cópias não fiéis ao original.